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原理：

3-氨基鄰苯二甲酰肼是一種較強的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，在存在辣根過氧化酶催化的條件下，可以被氧分子氧化成具有發(fā)光現(xiàn)象的中間體，當(dāng)中間體從激發(fā)態(tài)衰變到基態(tài)時可以產(chǎn)生明亮的化學(xué)熒光，常用于檢測固定在膜上的蛋白質(zhì)等生物大分子。其高靈敏度能夠檢測pg級別的抗原，發(fā)光信號強烈持久，可以使用照相技術(shù)（X-光膠片曝光）或者其他成像方法檢測。

操作步驟：

1、常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或核酸探針孵育、洗膜。

2、洗滌膜上的HRP標(biāo)記二抗時，新鮮配制發(fā)光工作液：分別取等體積的溶液A和B混合，放置使之升到室溫，否則會減弱熒光強度。建議立即使用工作液，室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

3、用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入并與發(fā)光工作液充分接觸(約0.125ml /cm2膜)。室溫孵育3-5分鐘，準(zhǔn)備立即壓片曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導(dǎo)致曝光條帶異常。發(fā)光過程的本質(zhì)是酶促反應(yīng)，使用過少的發(fā)光工作液不利反應(yīng)進行，也會導(dǎo)致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達(dá)節(jié)約目的可將膜剪小，但勿降低發(fā)光液用量。

4、用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。

5、在X光膠片暗盒內(nèi)面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將雜交膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹雜交膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋雜交膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，最好蛋白帶面向上。

6、在黑暗中放入X光膠片，分別曝光不同的時間如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。